Siprianus Bhuka

SEXING PADA BURUNG GEREJA (Passer montanus) MENGGUNAKAN METODE EXTRAKSI PCE (phenol Chloroform Extraction) DILANJUTKAN DENGAN ANALISA PCR.

KELOMPOK 3:
Di susun oleh :
Christian Bunardi (120801235)
Tania Holly V.A.N( 120801259)
Heri Susanto (120801291)
Siprianus Buka (120801275)
A. Latar Belakang
Burung Gereja (Passer domesticus) merupakan hewan yang monoformik (jenis kelamin dari burung dewasa dan anak sangat sulit untuk dibedakan), maka dari itu menggunakan metode PCR akan membantu untuk sexing dari burung gereja yang populasinya sangat besar dan merata pada setiap daerah. Berdasarkan literatur yang ada, maka kelompok kami akan lebih memilih menggunakan metode PCE karena lebih menguntungkan yang dimana hasilnya dapat kita lihat pemetaan genetiknya dari persebaran burung gereja yang ada di Jawa Tengah.
Teknologi marker dari burung gereja, dan DNA sequencing dari Burung Gereja yang menjadi target penelitian kelompok kami. Begitu juga dengan biaya yang dikeluarkan untuk metode PCE lebih murah dibandingkan extraction kit. Namun dalam menggunakan metode PCE ini harus berhati-hati karena metode ini menggunakan kloroform dan fenol yang berbahaya bagi manusia jika terhirup oleh manusia. Namun hasil yang didapatkan akan lebih baik menggunakan PCE yang dikarenakan menghasilkan ekstrak DNA yang lebih baik dari target yang akan diteliti dibandingkan menggunakan metode extraction kit.
B.Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui sexing pada burung gereja (Passer montanus) menggunakan metode ekstrasi PCE (phenol Chloroform Extraction) dan dilanjutkan dengan analisa PCR.
C.Persiapan dan Penyimpanan Sampel
Penelitian ini menggunakan darah yang berasal sayap burung gereja. Menurut Seutin dkk., (1991) darah burung diambil dengan menggunakan jarum suntik yang dibilas menggunakan 0,2 M potasium-EDTA pada vena jugularis burung. Pengambilan bulu dilakukan pada bulu sayap. Bagian sayap dibersihkan dengan kapas yang telah dibasahi dengan alkohol 70%, kemudian bulu dicabut secara perlahan dan disimpan dalam plastik (diberi label) sebagai sampel (Hendra, dkk., 2013).
Menurut Seutin dkk. (1991), ada empat cara untuk menyimpan sampel dalam waktu lama, yakni : disimpan dengan digumpalkan pada suhu -70°C, disimpan dengan digumpalkan pada suhu -20°C dan dikeringkan dalam bentuk film pada gelas benda pada suhu ruang (20-24°C), dan disimpan pada suhu ruang pada 1,0 mL pada lisis buffer (Queen’s Lysis Buffer). Komposisi dari Queen’s Lysis Buffer : 0.01 M Tris, 0.01 M NaCl, 0.01 M sodium EDTA and 10% n-lauroylsarcosine, pH 8.0. Namun pada penelitian ini akan menggunakan teknik penyimpanan ke empat dikarenakan EDTA dapat mencegah degradasi DNA, sehingga DNA yang dihasilkan memiliki kualitas yang baik.
D.Metode
Penelitian ini dapat menggunakan dua jenis metode, yakni metode PCE dan metode Silica. Berikut perbandingan prinsip kerja dari kedua metode :
1. Metode Berbasis Silica (Kit DNeasy Tissue)
Prinsip dari penggunaan metode ini adalah mengisolasi DNA berdasarkan adsorpsi selektif asam nukleat ke membran silika gel dengan adanya garam khaotropik dengan konsentrasi tinggi. Metode ini dirancang untuk isolasi yang cepat dari DNA total yang murni (genomik, virus, dan mitokondria) dari berbagai sumber sampel, termasuk sel-sel hewan segar dan beku, jaringan, yeast, dan darah.
2. Metode PCE (Phenol Chloroform Extraction)
Menurut Ausubel dkk. (1994), metode ini merupakan teknik konvensional yang menggunakan pelarut organik (EDTA) untuk mengekstrak kontaminan dari hasil pelisisan sel. Sel-sel dilisiskan menggunakan detergen, kemudian dicampur menggunakan fenol, kloroform, dan isoamil alkohol. Konsentrasi garam dan pH yang digunakan harus sesuai agar kontaminan dapat terpisahkan sempurna, yakni fase organik dan fase air yang berisikan DNA yang telah terpisahkan. Untuk meresuspensi DNA dapat dilakukan dengan penambahan alkohol. Menurut Heermann dkk. (1999), metode ini menggunakan fenol dan atau kloroform yang menghambat reaksi reaksi enzim, sehingga tidak cukup murni untuk aplikasi lanjutan seperti penggunaan PCR. Menurut Verhagen dkk. (1999), proses ini juga menghasilkan limbah beracun yang harus dibuang dengan penanganan khusus sesuai dengan pedoman limbah berbahaya.
Namun pada penelitian akan menggunakan metode PCE, dikarenakan pada volume sampel yang sama, konsentrasi DNA hasil ekstraksi menggunakan metode PCE lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi DNA hasil ekstraksi menggunakan metode ekstraksi kit. Hasil ini menunjukkan kelebihan metode PCE. Selain konsentrasi DNA yang lebih tinggi, biaya yang diperlukan untuk metode PCE lebih murah. Oleh karena itu metode PCE lebih cocok digunakan untuk penelitian yang tidak membutuhkan kemurnian DNA yang tinggi, seperti pemetaan genetik, teknologi marker, dan DNA sequencing (Wulandhari, 2009).
E. Metode Kuantifikasi DNA
Pada penelitian ini menggunakan metode kuantifikasi RNA yang menggunakan alat yang disebut Gene-Quant. Alat ini menggunakan prinsip spektrofotometer, berkas cahaya UV dilewatkan pada sampel dengan panjang gelombang tertentu untuk melihat kemurnian sampel tersebut. Kuantifikasi RNA umumnya mengukur purity, konsentrasi protein, konsentrasi RNA, dan Absorbansi (Sambrook and Russel, 2001).
Purity merupakan tingkat kemurnian sampel RNA, Purity didapatkan dari hasil ratio absorbansi A260/A280. Absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, artinya konsentrasi semakin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah absorbansi yang dihasilkan semakin rendah. Semakin banyak jumlah DNA yang terkandung dalam larutan, maka semakin kecil cahaya yang dapat diloloskan (Keenan 1992).
Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1,8–2,0 (Muladno, 2002). Menurut Devereux dan Wilkinson (2004) rasio OD260/OD280 2,0.
F. Analisis PCR
Molecular sexing berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode yang tepat, cepat, dan efektif untuk melakukan sexing (Reddy, 2007). Penanda yang digunakan adalah gen CHD (Chromohelicase-DNA-binding) (Griffiths dkk., 1998). Umumnya, gen CHD-W dan CHD-Z pada betina menghasilkan dua pita, sedangkan dua gen CHD-Z pada jantan menghasilkan satu pita (Quintana dkk., 2008). Beberapa spesies hanya menghasilkan satu pita pada betina karena tidak terdeteksinya salah satu gen. Dubiec (2006), menyatakan bahwa penentuan jenis kelamin lebih tepat dilakukan dengan cara menganalisis ukuran panjang basa pita. Primer-primer digunakan dalam penelitian kali ini antara lain pasangan P2-P8 (Griffths dkk., 1998), 2550F-2718R (Fridolfson dan Ellegren, 1999), serta 1237L-1272H (Khan dkk., 1998).
DNA yang diamplifikasi menunjukan hasil positif dikarenakan pada proses visualisasi muncul pola pita yang menunjukkan jantan dan betina. Visualisasi dari hasil PCR primer P2/P8 menggunakan gel agarose konsentrasi 3% dengan tegangan 100 volt selama 30 menit menghasilkan dua untaian pola pita DNA yang terpisah dengan jarak kromosom W (untuk betina) dan Z (untuk jantan) yang saling berdekatan. Jantan teridentifikasi dengan pola satu pita yang memiliki panjang, sedangkan betina teridentifikasi dengan pola dua pita. Demikian dengan pembacaan pola pita tersebut, kita dapat mengetahui sexing pada burung gereja.

DAFTAR PUSTAKA
Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. 1994. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons. New York.
Devereux, R. & S.S. Wilkinson. 2004. Amplification of Ribosomal RNA Sequences. Kluwer Academic Publisher. Netherlands.
Dubiec A., Magdalena Z.N., 2006. Molecular Techniques For Sex Identification In Birds. Biological Lett. 43(1): 3-12.
Griffiths, R., Mike, C.D., Kate, O., dan Robert, J.G.D. 1998. A DNA Test to Sex Most Birds. Molecular Ecology. 7: 1071-1075.
Heermann, K.H., Gerlich, W.H., Chudy, M., Schaefer S., and Thomssen, R. 1999. Quantitative Detection of Hepatitis B Virus DNA in Two International Reference Plasma Preparations. J. Clin. Microbiol. 37(1):68-73.
Hendra, Suryaningtyas, N.W.Y., Riyanto, C., Heryanto, A.F. 2013. Ekstraksi DNA Collocalia fuchiphaga dengan Metode Phenol Chloroform Extraction dari Berbagai Material Sumber Genetik. DITJEN DIKTI KEMDIKBUD RI.
Keenan,W. C..1992. Kimia Untuk Universitas Jilid 1. Erlangga. Jakarta.
Khan N. W., John J. S., Quinn T. W. 1998. Chromosome-Specific Intron Size Differences In the Avian CHD Gene Provide an Efficient Method for Sex Identification in Birds. The Auk 115(4):1074-1078.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.
Quintana, F., Gabriela C.L, Gustavo S. 2008. A Cheap and Quick Method for DNA-based Sexing of Birds. Waterbirds. 31 (3) :485-488.
Reddy, A. Vibhu Prakash dan S Shiveji. 2007. A Rapid, Non-invasive, PCR-Based Method for Identification of Sex of the Endangered Old World Vultures–Implications for Captive Breeding Programmes. Current Science, 92(5).
Sambrook J, Russel D W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition. Cold Spring Harbor. New York.
Seutin, G., B.N. White, dan P.T. Boag. 1991. Preservation of Avian Blood and Tissue Samples for DNA Analysis. Canadian Journal of Zoology. 69: 82-90.
Verhagen, O.J., Wijkhuijs, A.J., van der Sluijs-Gelling, A.J., Szczepanski, T., van der Linden-Schrever, B.E., Pongers-Willemse, M.J., van Wering, E.R., van Dongen, J.J., and van der Schoot, C.E. 1999. Suitable DNA Isolation Method for the Detection of Minimal Residual Disease by PCR Techniques. Leukemia. 13(8):1298-9.
Wirastika, P.I.P. 2013. Penggunaan Metode Molekular Sexing Untuk Penentuan Jenis Kelamin Burung Jalak Bali. E.Journal UAJY. 1-13.
Wulandhari, A. 2009. Optimalisasi Hasil Ekstraksi DNA dari Darah Segar Sapi Menggunakan High Salt Method dengan Perbandingan Darah dan Lysis Buffer pada Kecepatan Sentrifugasi Berbeda. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.


© 2021 Universitas Atma Jaya Yogyakarta
css.php