KSDL Buah

Pemisahan menggunakan gel (gel separation)

Posted: May 28th 2013

Pemisahan menggunakan gel (gel separation)

Pemisahan DNA dan RNA berdasarkan ukuran dengan elektroforesis pada berbagai sistem gel merupakan teknik dasar yang penting dalam biologi molekuler. Pada pH netral, DNA dan RNA bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke arah anoda. Jika migrasi dilakukan pada matriks polimer (gel), fragmen kecil akan bergerak lebih cepat daripada fragmen yang besar. Dengan demikian, migrasi elektroforetik melalui gel akan memisahkan campuran fragmen DNA sehingga nampak sebagai pita-pita yang berbeda ukurannya.

Banyak matriks gel yang dapat dignakan untuk pemisakhan asam nukleat, tapi yang paling banyak digunakan adalah gel agarose dan poliakrilamid. Gel agarose sesuai untuk pemisahan fragmen DNA yang berukuran 0.1-20 kb, sedangkan poliakrilamid untuk fragmen Dna berukuran 0.025-2 kb. Salah satu jenis elektroforesis gel agarose adalah pulsed field gel electrophoresis (PFGE) yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang sangat besar (lebih dari 1000 kb).

Untuk melihat fragmen DNA setelah dipisahkan dengan elektroforesis gel digunakan teknik lain. Jika fragmen DNA cukup banyak gel dapat langsung diwarnai (staining) selama atau setelah elektroforesis sehingga DNA dapat langsung dilihat. Ethidium bromide mengikat DNA dan akan berfluoresensi/berpendar merah dibawah sinar UV. Jika jumlah DNA terlalu sedikit untuk divisualisasi langsung, radioaktif digunakan untuk mendeteksi.

Hibridisasi asam nukleat

Hibridisasi asam nukleat adalah salah satu metode analisis yang paling sering digunakan. Teknik ini digunakan untuk Southern blotting, Northern blotting dan untuk skrining library. Tujuan metode ini adalah untuk melihat (visulisasi) sekuens asam nukleat tertentu (DNA atau RNA) dalam lingkungan/latar belakang campuran sekuens lain yang kompleks. Teknik ini memanfaatkan sifat DNA yaitu dua untai asam nukleat yang komplemen akan saling mengikat (hibridisasi) dengan tingkat spesifisitas yang tinggi.

Southern Blotting

Southern blotting dimulai dengan pemisahan elektroforesis gel fragmen DNA yang telah didigesti dengan enzim pemotong. DNA kemudian didenaturasi (dipisahkan menjadi 2 untai tunggal) dengan perlakuan alkali, selanjutnya untai tunggal ditransfer ke membran melalui transfer kapilaritas. DNA akan terikat pada secara kovalen pada membran dan diimobilisasi pada fase padat, menghasilkan replika fragmen pada gel. Fagmen DNA spesifik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen gen yang dikehendaki.

Northern Blotting

Pemisahan gel dan hibridisasi asam nukleat dapat juga untuk analisis RNA menggunakan prosedur Northern blotting. Beberapa hal yang membedakan dengan Southern blotting adalah: (1) RNA jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena itu elektroforesis dilakukan dalam buffer yang mengandung zat kimia yang bersifat melindungi (biasanya formaldehid), (2) RNA sudah berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih ringan, (3) RNA biasanya berukuran tertentu sehingga tidak memerlukan digesti enzim untuk memperoleh pola pita.

Gambar 1. Southern blot. DNA genom diisolasi dan digesti dengan enzim restriksi. DNA kemudian dirun pada gel agarose dan ditransfer ke membran di mana DNA kemudian diikatkan secara kovalen. DNA selanjutnya dihibridisasi menggunakan probe yang dilabel 32P. Interaksi antara DNA dan probe yang dilabel dideteksi dengan cara memajankan DNA-membran ke film otoradiografi.

(Sumber : Lyrawati,2003)

Oleh Ignatia Dinary Putri 100801140


6 responses to “Pemisahan menggunakan gel (gel separation)”

  1. yareyare says:

    Tulisan yang menarik karena sudah berusaha menampilkan berbagai teknologi molekuler, tetapi akan lebih baik jika ditulis dengan bahasa yang lebih komunikatif dan lebih mudah dimengerti.
    Mungkin dapat ditambahkan rekomendasi teknik mana yang paling baik untuk jenis-jenis penelitian tertentu

  2. Jovita says:

    wahh bagus..ternyata ada teknik lain yang bisa digunakan dari elektroforesis agarose, biasanya pakai PAGE, ternyata ini ada yang PFGE..baru tau.. 🙂

  3. Cellica says:

    Tulisan yang menarik karena sudah berusaha menampilkan berbagai teknologi molekuler, tetapi akan lebih baik jika ditulis dengan bahasa yang lebih komunikatif dan lebih mudah dimengerti..
    Mungkin dapat ditambahkan rekomendasi teknik mana yang paling baik untuk jenis-jenis penelitian tertentu

  4. Jovita says:

    iye baru tau beb..hahaha

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

© 2021 Universitas Atma Jaya Yogyakarta
css.php