Aplikasi molecular sexing pada Gelatik Jawa

ABSTRAK

Penentuan jenis kelamin penting dalam kajian ekologi dan biologi konservasi. Untuk jenis burung monomorfik, seperti Gelatik Jawa,  penentuan jenis kelamin tidak mudah dilakukan, lebih-lebih untuk individu yang belum dewasa.  Penelitian ini menjabarkan aplikasi molekuler sexing pada  Gelatik Jawa, dengan metode PCR dan penanda molekuler dari Gen CHD (chromobox-helicase-DNA-binding).  Pasangan primer yang digunakan adalah 2550F  dan 2718R.   Jumlah sampel total sebanyak 66 individu dewasa dan 20 anakan burung. Hasil amplifikasi dengan PCR divisualisasi dengan elektroforesis gel agar (3%).  Berdasarkan pola pita semua sampel bisa diindetifikasi jenis kelaminnya.  Uji chi squire  mengindikasikan bahwa rasio jenis kelamin pada Gelatik jawa, baik pada populasi dewasa maupun anakan tidak menyimpang dari rasio 1:1.

PENDAHULUAN

Kepastian identifikasi jenis, individu dan jenis kelamin sangat penting dalam kajian ekologi dan aplikasinya dalam biologi konservasi.  Namun, informasi tentang jenis kelamin dan rasionya dalam suatu populasi masih sangat terbatas. Salah satu penyebabnya adalah kesulitan dalam mengidentifikasinya. Lebih dari  separuh jenis burung termasuk monomorfik, antara jenis jantan dan betina  sulit dibedakan secara langsung (berdasarkan morfologi eksternal). Metode yang telah dikembangkan untuk identifikasi jenis kelamin burung tidak efisien dan ada juga yang menimbulkan resiko tinggi (Cerit dan Acanus,  2007).

 

Untuk mengatasi permasalahan ini telah dikembangkan teknik DNA untuk identifikasi jenis kelamin. Sejauh ini telah dikembangkan beberapa metode berbasis pada teknik DNA ini. Teknik tersebut menggunakan gen yang terletak pada kromosom sex. Burung betina memiliki kromosom Z dan W, sementara burung jantan dua kromosom Z.  Beberapa penanda molekuler sudah digunakan untuk teknik ini. Saitoh et al.(1991) menggunakan primer XhoI untuk mengidenfikasi jenis kelamin ayam. Teknik yang sama digunakan Petitte dan Keglemeyer (1992) bahkan untuk embrio ayam.  Keduanya mengunakan teknik PCR. Canon et al. (2000) menggunakan metode analisis flow cytometric  DNA inti,  berhasil mengidentifikasi jenis kelamin tiga jenis burung paruh bengkok. Marka RAPD telah dikembangkan oleh Welsh dan McClelland (1990) dan Williams et.al (1990). marka ini hanya mengamplifikasi kromosom w pada jenis burung betina. Marka lain yang telah digunakan untuk identifikasi jenis kelamin adalah mikrosatelit (Nesje dan Røed, 2000), minisatelit (Miyaki et al.,1997), AFLP (Griffiths dan Orr,1999), RFLP (Quinn et al., 1990) dan yang sekarang paling banyak digunakan adalah gen CHD (chromo-helicase-DNA-binding) (Griffths et al., 1998). Burung betina memiliki gen CHD1-W dan CHD1-Z , sedangkan burung jantan memiliki dua gen CHD1-Z. Hasil amplifikasi gen tersebut menunjukan dua pita pada betina dan satu pita pada  jantan.

 

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi jenis kelamin burung Gelatik jawa (Padda oryzivora)  dengan menggunakan pendekatan molekuler. Pada saat ini Gelatik jawa populasinya sangat sedikit dibandingkan dengan kondisinya sebelum tahun tujuh puluhan.  Dengan kondisi yang ada IUCN telah memasukan burung ini dalam kategori Rentan /Vulnerabel  (BirdLife International,2012). Kajian ekologi populasi Gelatik jawa untuk menduga nasibnya dimasa mendatang memerlukan data demografi. Data tersebut tidak terbatas pada populasi total, tetapi lebih detil tentang struktur populasi dan seks rasionya. Untuk data yang terakhir tentunya sangat diperlukan identifikasi jenis kelamin.

 

Gelatik jawa berdasarkan morfologinya relatif sulit dibedakan antara burung jantan dan betina.  Pada saat musim berbiak, bagi yang terlatih, bisa melihat tanda-tanda perbedaan keduanya pada ukuran dan bentuk paruh dan warna lingkar matanya.  Namun diluar masa berbiak sulit membedakan burung dewasa yang jantan atau betina, lebih-lebih pada burung anakan atau mudanya.

METODE PENELITIAN   

Sampel

Total sampel yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 66 individu burung dewasa dan 20 individu burung remaja. Sampel darah untuk sumber materi DNA diperoleh dari cara memotong ujung kuku burung. Darah yang keluar diambil dengan pipa mikrokapiler dan disimpan dalam larutan penyangga (Queens’ Lysis Buffer) pada tabung mikro (1,5 ml).   Ekstraksi DNA dari darah tersebut menggunakan metode ekstraksi fenol-kloroform  (Sambrook et al. 1989) atau DNeasy® Tissue Kit (Qiagen Pty Ltd), sesuai dengan metode untuk darah binatang.

PCR

Identifikasi jenis kelamin Gelatik jawa menggunakan metode PCR yang dikembangkan oleh Fridolfsson dan Ellegren (1999). Pasangan primer yang digunakan adalah 2550F (5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA -3’) and 2718R (5’- ATTGAAATGATCCAGT GCTTG -3’). Volume reaksi PCR 25 ul dengan komposisi 10-20 ng DNA; 10x PCR Buffer (200mM Tris-HCl (pH 8.4); 500mM KCl); 2.0mM MgCl2; 5 pmol tiap primer; 0.15 mM tiap dATP, dTTP, dCTTP, dGTP dan 1 unit  Tag polymerase (Life Technology). Kondisi siklus PCR adalah sebagai berikut: pre denaturasi 94oC 2 menit; 30 kali siklus denaturasi pada suhu 94oC (30 detik), penempelen primer (annealing) pada suhu  50oC selama 45 detik, dan elongasi/ekstensi pada suhu 72oC (30 detik), dan ekstensi akhir pada suhu 72oC (5 menit). Hasil amplifikasi divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa (3%) dengan larutan penyangga TBE dan pewarna ethidium bromida.

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil PCR dan elektroforesis menunjukan bahwa semua sampel Gelati jawa teramplifikasi, menunjukan adanya pita tunggal atau pita ganda. Pita tunggal berukuran 650 bp, mengindikasikan sampel tersebut memiliki gen CHD1Z dan berarti berjenis kelamin jantan.  Sedangkan yang berpita ganda memiliki ukuran  450 dan 650 bp, mengindikasikan sampel tersebut betina, yang memiliki gen CHD1 W dan CHD1 Z.  Hasil ini menambah bukti kegunaan pasangan primer 2550F dan 2718R dalam mengindentifikasi jenis kelamin burung monomorfik dari suku Estrildidae.  Pada awalnya Fridolfsson dan Ellegren (1999)  mengaplikasikan metode ini pada 50 jenis burung dari berbagai ordo. Suku estrildidae belum ada wakil dalam uji awal tersebut.

Jumlah total sampel individu burung dewasa adalah 66. Hasil elektroforesis produk PCR menunjukan 29 betina (berpita dua) dan 37 jantan (berpita tunggal).  Sementara itu pada sampel burung muda (20 ekor), hasilnya 12 burung berjenis kelamin betina dan 8 jantan.  Hasil ini mengindikasikan bahwa rasio jenis kelamin (sex ratio) burung Gelatik jawa adalah 1:1 ( (X2 = 0.97; P= 0.32 and X2 = 0.80; P= 0.37, masing-masing untuk burung dewasa dan burung muda).

Reference

BirdLife International, 2012, Species factsheet: Padda oryzivora. Downloaded from http://www.birdlife.org.

CERIT, H. and K. ACANUS,  2007, Sex identification in avian species using DNA typing methods, World’s Poultry Science Journal, 63: 91-99

CANON, N.R., TELL, L.A., NEEDHAM, M.L. and GARDNER, A.A. (2000) Flow cytometric analysis of nuclear DNAfor sex identification in three psittacine species. American Journal of Veterinary Research61: 847-850.

CLINTON, M.(1994) Arapid protocol for sexing chick embryos. Animal Genetics25: 361-362.

CANON, N.R., TELL, L.A., NEEDHAM, M.L. and GARDNER, A.A. (2000) Flow cytometric analysis of nuclear DNA for sex identification in three psittacine species. American Journal of Veterinary Research 61: 847-850.

FRIDOLFSSON,A.K. and ELLEGREN, H. (1999) Molecular evolution of the avian CHD1 genes on the Z and Wsex chromosomes. Genetics155: 1903- 1912.

GRIFFITHS, R., DOUBLE, M.C., ORR, K. and DAWSON, R.J. (1998) ADNAtest to sex most birds. Molecular Ecology7: 1071 -1075.

GRIFFITHS, R. and ORR, K. (1999) The use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) in the isolation of sex-specific markers. Molecular Ecology8: 671-674.

KAHN, N.W., JOHN, J. and QUINN, T. (1998) Chromosome-specific intron size differences in the Avian CHD gene provide an efficient method for sex identification in birds. The Auk115: 1074 -1078.

MIYAKI, C.Y., DUARTE, M.B., CAPARROZ, R., NUNES, A.V. and WAJNTAL, A. (1997) Sex identification of South American Parrots (Psittacidae, Aves) using the human minisatellite probe 33.15. The Auk 114: 516-520.

NESJE, M. and RØED, K. (2000) Sex identification in falcons using microsatellite DNAmarkers. Hereditas 132: 261-263. 

PETITE, J.N. and KEGELMEYER, A.E. (1992) Sex Determination of chick embryos using a W chromosome-specific oligonucleotide probe and PCR. Proceedings of the XIX World’s Poultry Congress  Amsterdam 531.

QUINN, T.W., COOKE, F. and BRADLEY, N.W. (1990) Molecular sexing of geese using a cloned Z chromosomal sequence with homology to the Wchromosome. Auk107:199-202.

SAITOH,Y.,SAITOH,H.,OHTOMO,K. and MIZUNO,S.(1991) Occupancy of the majority of DNAin the chicken W-chromosome by bent-repetitive sequences. Chromosoma101: 32-40.

WELSH, J. and MC CLEALLAND, M. (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Research18: 7213-7218.

 

WILLIAMS, J.K.G., RUBELIK,A.R., LIVAK, K.J., RAFALSKI, J.A. and TINGLEY, S.V. (1990): DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Research18: 6531- 6535.

 

This entry was posted in Ekologi molekuler. Bookmark the permalink.

2 Responses to Aplikasi molecular sexing pada Gelatik Jawa

Leave a Reply