Wildlife

Analisis Metagenom Mikrobioma Usus Anjing (Canis lupus familiaris) dan Pengaruhnya terhadap Tingkat Nafsu Makan

Posted: March 3rd 2015

Mandi atau tidak memiliki satu persamaan yang mengejutkan: mikrobia pada tubuh tidak 100% mati. Jadi, kalau Anda berpikir mandi sangat diperlukan untuk membunuh kuman-kuman yang ada di tubuh, Anda tentu salah. Mandi memang tidak menjanjikan Anda 100% bersih, bukan karena cara mandi Anda yang secepat kilat, bukan juga karena penggunaan sabun non-antiseptik. Tubuh kita tidak bisa 100% “bersih” atau terbebas dari mikrobia karena tubuh kita sudah bersimbiosis dengan berbagai bakteri sejak kita lahir. Hal ini tidak hanya terjadi pada manusia, tetapi seluruh hewan. Mikrobia yang alami hidup pada tubuh hewan disebut animal microbiome.

Animal microbiome dapat dijumpai di seluruh bagian tubuh hewan. Mulai dari bagian terluar, seperti bulu, rambut, kulit, hingga bagian terdalam seperti usus. Jumlahnya juga tidak tanggung-tanggung. Contoh mudah adalah pada manusia yang tersusun dari 1013 sel hidup memiliki animal microbiome (atau pada umumnya disebut human microbiome) sebanyak 1014 sel, lebih banyak dibanding sel penyusun tubuh manusia.

Animal microbiome tidak bersifat patogen terhadap inangnya, melainkan berperan dalam berbagai hal baik. Antarspesies hewan memiliki sususan animal microbiome yang berbeda-beda. Penelitian sudah membuktikan, kelainan pada suatu hewan bisa diakibatkan oleh hilangnya satu jenis atau lebih animal microbiome yang umumnya terdapat pada teman satu spesiesnya.

Salah satu penelitian yang cukup populer di bidang ini adalah analisis pengaruh animal microbiome terhadap perilaku hewan yang bersangkutan, di antaranya adalah tingkat depresi. Penelitian tersebut menggunakan tikus sebagai objek penelitian dan menemukan bahwa tikus yang diberi probiotik Lactobacillus rhamnosus lebih berani ketika dipaksa berenang dan cenderung memiliki tingkat kekhawatiran yang rendah dibanding yang tidak memiliki Lactobacillus rhamnosus dalam sistem pencernaannya (Bravo dkk., 2011). Contoh lainnya adalah individu dengan keragaman mikrobia tinggi pada kulitnya bisa membuat nyamuk tertentu tidak tertarik untuk menghisap darah individu yang bersangkutan, bahkan untuk menempel sekali pun (Verhulst dkk., 2011). Penelitian dalam dunia animal microbiome cenderung menggunakan identifikasi secara molekuler mengingat jumlah mikrobia yang diidentifikasi berada dalam jumlah besar dan sangat beragam sehingga identifikasi secara konvensional sangat tidak dimungkinkan.

MICROBIOME ALTER BEHAVIOR

Gambar 1. Mikrobioma yang mempengaruhi perilaku (Ezenwa dkk., 2012)

Dalam rancangan penelitian ini, kami hendak menganalisis komunitas mikrobia yang ada pada usus dari dua individu Canis lupus familiaris. Yang menarik di sini adalah, kedua anjing peliharaan ini hidup dalam lingkungan dan perilaku pemeliharaan yang sama, namun keduanya memiliki pola makan yang sangat berbeda di mana salah satu dari kedua anjing tersebut memiliki tingkat nafsu makan yang tinggi, sementara yang lain menunjukkan perilaku yang berlawanan. Pada anjing pertama dengan nafsu makan tinggi juga dijumpai perilaku aktif, riang, dan berani, sementara anjing kedua dengan nafsu makan rendah memiliki tingkat kecemasan yang sangat tinggi dan cenderung pendiam. Kami mengindikasikan bahwa mikrobia pada masing-masing usus kedua anjing tersebut memegang peranan penting berkaitan dengan hal ini, seperti halnya pada penelitian terdahulu.

 

Tujuan penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi jenis mikrobia apa saja yang terdapat pada usus masing-masing anjing dan mengetahui mikrobia apa yang berperan penting dalam menentukan perilaku pada setiap anjing.

 

Sampel

Sampel yang digunakan berupa feses anjing yang masih terdapat lendir difesesnya.

 

Teknik Pengambilan dan Penyimpanan Sampel DNA dari Feses (Savira, 2012):

  1. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah tabung plastik 50 ml (Biologix, Kansas, Amerika Serikat), lidi dan sedok plastik.

Bahan yang digunakan adalah sampel feses, buffer penyimpanan DMSA/EDTA/Tris/larutan garam dan sarung tangan.

  1. Cara Kerja

Sampel feses yang ada dilihat lendir pada permukaanya. Tanda-tanda lain yang perlu diamati yaitu warna kotoran (cokelat terang hingga pekat). Setelah itu, feses kemudian dikikis pada bagian permukaanya yang berlendir lalu dimasukkan ke dalam tabung Biologix sebanyak 2-5 gram yang telah berisi 20 ml buffer penyimpanan DMSO/EDTA/Tris/larutan garam dengan rasio 1:4. Tabung yang telah berisi sampel ditutup kemudian diberi kode sampel. Feses tidak diawetkan dan tidak didinginkan. Lalu feses diperiksa lebih lanjut < 24 jam setelah pengambilan.

 

Metode Ekstraksi DNA

Ektraksi DNA dari sampel feses anjing yang digunakan adalah ekstraksi organik. Penggunaan metode ini dikarenakan sampel feses yang digunakan berasal dari hewan vertebrata yakni anjing, sehingga secara konvensional, metode ini sangat baik digunakan disamping kelebihan lainnya adalah menghasilkan DNA dengan kualitas terbaik (tingkat kemurnian tinggi). Prosedurnya adalah sebagai berikut :

Tahap Persiapan

  1. Penghalusan atau pemecahan (macerasi dan dispersi)   jaringan materi. Teknik yang  digunakan tergantung pada        materi yang digunakan. Metode yang umum adalah pembubukan dengan nitrogen cair, jika        materi  tersedia cukup banyak.
  2. Materi yang sudah halus dicampur dengan larutan penyangga, dengan perban dingan 1 : 3 (1 volume materi : 3       volume larutan penayangga. Larutan penyangga yang umum digunakan adalah larutan penyangga Lifton. Tabung mikro yang        digunakan adalah ukuran 1,5 atau 2 ml.
  3. Tambahkan Protenease K (10 mg/ML) sebanyak 1/50 volume materi dan larutan penyangga. Inkubasi sampel pada suhu      65°C selama 2 jam sampai semalam. (Perlu diperhatikan volume air jika menggunakan waterbath /penanggas air untuk inkubasi : jangan sampai kehabisan saat di tinggal selama semalam)
  4. Tambahkan 5 M potassium/kalium asetat, campur dengan membolak-balikan tabung secara baik. Inkubasi pada es selama 30 menit.
  5. Sentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Pindahkan superna- tan(bagian atas yang bening) ke tabung mikro baru.

Tahap Isolasi DNA

  1. Tambahkan PCI, dengan volume sama dengan supernatan (hasil dari tahap a.5)
  2. Campur larutan tesebut dengan membolak-balikan tabung beberapa kali.
  3. Sentrifus tabung dengan kecepatan antara 3000 rpm sampai 5000 rpm selama 5 menit. Pada tabung akan terbentuk dua lapisan : bagian atas berisi asam nukleotida dan bagian bawah adalah bagian organik. Pindahkah cairan bagian atas ke tabung baru.
  4. Jika sampelnya sangat jarang, maka ekstraksi ulang bisa dilakukan dengan cara menambah larutan TE, dengan volume sama, pada larutan bagian bawah (bagian fenol). Setelah dicampur, spin tabung dengan kecepatan 3000 rps sam pai 5000 rpm. Larutan bening bagian atas diambil dan bisa digabung dengan hasil tahap 3.
  5. Tambahkan kloroform, dengan volume sama dengan volume hasil tahap 3. Campur dengan baik, dengan cara membolak-balikan beberapa kali.
  6. Spin tabung dengan kecepatan 3000 rpm sampai 5000 rpm selama 5 menit.
  7. Ambil lapisan atas dari larutan dan masukan ke tabung baru.

Tahap Purifikasi DNA

  1. Tambahkan ethanol (95-100%) dingin, kocok tabung beberapa kali. Biarkan terjadi presipitasi DNA dengan meletakan tabung tersebut dalam freezer (-20°C) selama 10 menit. (Catatan : eksperimen terbaru mengindikasikan bahwa tahap ini lebih baik hasilnya jika presipitasi pada suhu 0°C).
  2. DNA dikoleksi dengan cara spein tabung pada mikrosintrifus dengan kecepatan maksimum.
  3. Ethanol dituang dengan hati-hati. Pelet diresuspensi dengan menambahkan 0.5 mL larutan penyangga TE.
  4. Tambahkan 0.3 ml 5 M ammonium asetat dan 1 ml 100% ethanol, untuk presipitasi tahap kedua. Tempatkan larutan dalam suhu (-20°C) selama 10 menit.
  5. Spin tabung dengan kecepatan maksimum. Supernatan ethanol dituang dengan hati-hati. Pelet DNA akan tertinggal di dinding dasar tabung.
  6. Resuspensi pellet DNA dengan air (dH2O) atau larutan penyangga TE.

 

Metode Kuantifikasi DNA

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metde spektrofotometri. Uji kuantifikasi DNA bertujuan untuk mengetahui konsentrasi DNA dan kemurnian DNA yang didapatkan dari proses isolasi DNA. Uji kuantitatif DNA menggunakan spektrofotometri UV-vis, yaitu spektrofotometer yang mempunyai teknologi nano. DNA murni bisa menyerap cahaya UV karena adanya basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA menyerap cahaya UV pada 260 nm, sementara itu kontaminan (protein atau fenol) akan menyerap cahaya pada panjang gelombang 280nm. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi λ260 nm dibagi dengan nilai absorbansi λ 280 (Å260/Å280). Kemurnian DNA berkisar 1,8-2,0 (Harjadi, 1986). Jumlah DNA yang didapatkan ini nantinya berhubungan dengan hasil PCR.

Prinsip dari alat ini adalah spektrofotometri, yaitu melewatkan sinar pada kuvet sehingga terdeteksi kekeruhan cairan dalam kuvet oleh DNA. Konsentrasi yang baik berkisa antara 1,8-2,0. Jadi, dengan kata lain jika angkanya <1,8 atau >2,0 maka DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang rendah.

Dalam kuantifikasi, DNA yang sudah kita dapatkan pada acara isolasi DNA sebelumnya konsentrasi DNA dari seluruh sampel diseragamkan menjadi 50 µg/ml dengan pengenceran (Sambrook dkk, 1989) Caranya yaitu dengan menambahkan 100 mikroliter aquabides. Setelah itu diambil sebanyak 1 mikroliter enceran DNA+49 mikroliter aquabides. Diambil sebanyak 2 mikroliter DNA, diletakkan kedalam kuvet Tambahkan sebanyak 2 ml aquabides

Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus berikut:

 

[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran

 

Å260   = nilai absorbansi pada λ260 nm

50         = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 untai ganda DNA per mL.

 

Analisis Lanjut

Dalam hal ini, analisis lanjut yang dilakukan adalah analisis metagenom mikrobioma usus Canis lupus familiaris. Genom uniseluler umumnya terdiri dari sedikit bagian yang berulang yang sulit diurutkan dan genom ini tergolong mudah untuk diurutkan. Berbeda halnya dengan genom dari makhluk multiseluler yang lebih sulit diurutkan. Hal tersebut juga berlaku untuk mikrobia pada usus yang terdiri dari berbagai jenis mikrobia dengan masing-masing genomnya. Untuk mengatasi permasalahan ini, para peneliti sudah mulai mengandalkan shotgun sequencing untuk analisis metagenom (Adam, 2008).

Dalam teknik ini, kumpulan DNA yang sudah terekstrak kemudian dipotong dan diurutkan (Tatusov, 2000). Metode ini mampu mengurutkan banyak fragmen DNA yang tumpang tindih akibat pengulangan dalam jumlah banyak dalam bentuk pararel dan kemudian menggunakan komputer mengumpulkan potongan-potongan kecil menjadi lebih besar hingga akhirnya membentuk kromosom (lihat Gambar 2) (Adam, 2008). Untuk mengidentifikasi komunitas mikrobia penyusun mikrobioma usus digunakanlah berbagai database, seperti Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) atau Clusters of Orthologous Groups (COG)—untuk memperoleh jalur individu atau penempatan gen. Hal tersebut menyediakan daftar sekuens gen dan klasifikasi COG yang sesuai dalam sampel (Tatusov dkk., 2000).

SHOTGUN SEQUENCING

Gambar 2. Ilustrasi Shotgun Sequencing (Sumber: Adam, 2008)

Setelah diketahui mikrobia penyusun mikrobioma usus dari masing-masing anjing, selanjutnya adalah membandingkan mikrobia dari kedua anjing tersebut. Harapannya, dari penelitian ini kami bisa menemukan mikrobia apa yang berperan dalam meningkatkan perilaku tertentu, khususnya nafsu makan, sehingga nantinya dapat diperoleh jalan keluar untuk mengatasi problema nafsu makan pada anjing maupun hewan peliharaan lainnya.

TUGAS MATA KULIAH “TEKNOLOGI MOLEKULER”

Salam hangat penuh cinta,

Bhumi (11080)

Unan (120801257)

Mia (120801274)

Santa (120801290)

 

Referensi

Adams, J. 2008. Complex genomes: Shotgun sequencing. Nature Education. 1(1):186.

Ezenwa, V.O., Gerardo, N.M., Inouye, D.W., Medina, M., dan Xavier, J.B. 2012. Animal Microbiome and the Behavior. Science. 338:198-199.

Harjadi, W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Gramedia, Jakarta.

A. Bravo et al. 2011. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 16050.

O. Verhulst et al. 2011. PLoS ONE 6. e28991.

Sambrook. J., Fritsch, E.F., dan Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press. University of Texas South Western Medical Centre, Texas.

Savira, M. 2012. Analisis Variasi D-Loop DNA Mitokondria pada Populasi Gajah Sumatera (Elephas maximus sumatranus) di Taman Nasional Way Kambas. Skripsi S-1. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Tatusov RL, Galperin MY, Natale DA, Koonin EV. 2000. The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution. Nucleic Acids Res. 28:33–36.

 


Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

© 2020 Universitas Atma Jaya Yogyakarta
css.php